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制片技術

冷凍切片

一、 恒溫冷凍切片

將組織在恒溫冷凍切片機里切片。冷凍腔內的溫度一般設置為-18至-25℃,根據不同組織調節不同

的腔溫,平時應將冷凍頭放置于冷凍臺上。冷凍切片機應長期處于恒溫冷凍狀態。

(1)、 當冰凍組織取好后,有速凍開關的機器可先將開關打開,再在冷凍頭上放少量的OCT或羧甲基

纖維素(可用普通膠水代替),放上組織,速凍。

(2)、 待組織凍結后,將冷凍頭裝到切片機上

(3)、 粗切,修出切面細切幾張,用毛筆刷去刀上組織片

(4)、 放下抗卷板,開始切片,切片厚度一般為5~6微米,切出的片子用載玻片貼附后立即放入甲醇

冰醋酸液(97ml甲醇+3ml冰醋酸)中固定,固定時間為10~20秒

(5)、 水洗

(6)、 蘇木素1分鐘

(7)、 水洗

(8)、 鹽酸酒精分化1秒鐘

(9)、 水洗

(10)、溫水藍化

(11)、伊紅2~5秒鐘

(12)、梯度酒精快速脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固。

冰凍切片的注意事項:

(1) 速凍:是冰凍切片的關鍵,因為只有速凍才能減少組織內的冰晶,最好的辦法是將速凍頭迅速壓

在組織上,凍好后就可切片。特別適用于較脆的組織。而含有脂肪較多的組織,最好放在液氮里處

理。在液氮里冷凍要注意不要凍過頭,2~3秒鐘就要拿出來看一下,只要有4/5的組織已經凍住就可

以了,待冷凍頭拿出后剛好全部凍住,否則就會引起組織發脆,或冷凍頭與組織分離。

(2)固定:切片后應立即放入甲醇冰醋酸中固定,不能等切片干后再固定,后者容易造成細胞退變。

固定液有很多種,根據我們的實踐,認為甲醇作用快,收縮小,染色較清晰,是冰凍切片最理想的固

定液, 而每97ml加入冰醋酸3ml,會減少某些膠質、鈣質較多的組織不容易掉片。

(3)包埋劑:可用普通膠水代替,但要加入適量的水(膠水與水的比例大約在2:1左右)。太稀了,

容易損傷切片刀;太稠了,粘在切片上不容易洗掉,影響切片的質量。

(4)冰凍用切片刀不僅要磨的快,而且要磨的直,否則切出的片子就不會平整,不能進入抗卷板。最好

能使用一次性刀片。

(5)如組織發脆,可等幾分鐘后再切,也可用手在組織上稍稍加溫;如果用手去摸組織塊,最好戴手

套,或用玻片間的紙夾在手與組織之間,以防感染。

(6)冷凍室的溫度冬天一般設在-19℃左右,夏天設在-22℃左右。不同的組織,有不同的溫度要求:肝

臟、甲狀腺組織溫度控制在-15℃左右,脂肪組織一般在-35℃以下。

(7) 冷凍切片機應長期處于恒溫冷凍狀態,經常的開關機器電源容易造成壓縮機損傷。

二、半導體制冷切片

(1) 組織放置在半導體制冷臺上,加少量水,調好切片的厚度

(2) 接通循環流水后,再接通電源,在使用的全過程中不能中斷流水,等電源關上后才能停水。并且

正負極不能接反,用整流電源控制溫度。冷凍組織周圍的水不能過多

(3) 待組織發硬到可切成厚薄一致的切片時,即可切片。切片厚度5~6微米,切片用毛筆展平后,立

即放入甲醇冰醋酸液中固定,固定時間為1分鐘

(4) 蘇木素1分鐘

(5) 水洗

(6) 鹽酸酒精分化1秒鐘

(7) 水洗

(8) 溫水藍化

(9) 伊紅2~5秒鐘

(10) 梯度酒精快速脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固。

三、二氧化碳冷凍切片

a) 先將組織放入加熱的20%甲醛溶液中固定1~2分鐘,水洗(也可將組織不經固定直接放在切片機的

冷凍臺上)

b) 放在切片機的冷凍臺上,加少量水,打開二氧化碳開關,此時有二氧化碳氣體噴出,待組織出現

冷霜后,關閉二氧化碳

c) 切片,切片厚度6~8微米,將切出的片子放于水中舒展,用鑷子將組織平鋪于載玻片上(如未固定

組織的切片直接用載玻片粘貼,立即放入甲醇中固定2秒,然后進行染色,)

d) 加熱烤片,烤片溫度不宜超過60℃,更不能將組織烤焦。

e) 染色時將蘇木素滴加在載玻片上,加熱1分鐘(60℃左右,不能將蘇木素燒開,以防切片脫落)

f) 水洗

g) 鹽酸酒精分化1秒鐘

h) 水洗,溫水藍化

i) 伊紅2~5秒鐘

j) 梯度酒精快速脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固。

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時  間:2020-09-27 17:54

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